單四極桿GC-MS系統(tǒng)進(jìn)行分子式測定的校正穩(wěn)定性
EI廣泛用于氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)，在EI過程中，分子離子常常被碎裂成多個(gè)碎片離子，盡管樣品所測得的質(zhì)核比(m/z)和譜庫比較僅有±0.5 Da準(zhǔn)確度，但這些EI碎片離子通過譜庫檢索(如NIST)可以提高MS的化合物識別能力，因此，EI譜庫檢索已經(jīng)成為GC-MS化合物識別的選擇方法。雖然該方法可以很好地滿足一些日常應(yīng)用，但如果很多化合物具有相似的高檢索分?jǐn)?shù)時(shí)，化合物識別就變得含糊不清了。在一些苛刻應(yīng)用中，如雜質(zhì)和降解物識別，藥物、化學(xué)品、食品和香精、香料行業(yè)中的活性組分測定，這些不明化合物可能不在譜庫中，因此，這類應(yīng)用就需要高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)如GC-TOF測量質(zhì)量數(shù)，這類儀器是非常昂貴的，而且需要更高的維護(hù)費(fèi)用。質(zhì)量測定可以進(jìn)一步確定譜庫搜索結(jié)果，或通過分子離子及重要的碎片離子確定元素組成。 在另一篇文章中，Chen及其團(tuán)隊(duì)[1]報(bào)道了通過新的校正方式，精密地校正了m/z和質(zhì)譜的線形譜圖，在傳統(tǒng)四極桿GC-MS系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)了極高的質(zhì)量測定。由于這個(gè)精密設(shè)計(jì)的校正方式涉及質(zhì)量準(zhǔn)確度和譜圖準(zhǔn)確度，關(guān)于這個(gè)校正及其實(shí)際應(yīng)用的穩(wěn)定性問題隨之出現(xiàn)。 本文針對傳統(tǒng)單四極桿GC-MS系統(tǒng)元素組成識別的影響因素，質(zhì)量準(zhǔn)確度和譜圖準(zhǔn)確度兩個(gè)方面，設(shè)計(jì)一個(gè)校正穩(wěn)定性研究程序并將結(jié)果展現(xiàn)給大家。 原理 傳統(tǒng)的質(zhì)譜校正僅確定質(zhì)量數(shù)，而不考慮儀器線形譜圖，儀器線形譜圖大大影響質(zhì)量數(shù)測定，特別是在單位質(zhì)量分辨儀器如四極桿GC-MS系統(tǒng)。開發(fā)的新校正方式[2, 3]不僅校正了質(zhì)量軸，而且也校正了儀器的線形譜圖，由于質(zhì)譜的理論峰位(它們是相關(guān)離子的質(zhì)量和)可以非常準(zhǔn)確的知道，另外，我們也可以準(zhǔn)確地知道不同同位素及其豐度，通過這些信息可以計(jì)算出校正函數(shù)，不但校正峰的位置，而且也校正儀器的線形譜圖。 實(shí)際儀器的線形譜圖常常是未知且很難定義，通過這個(gè)新技術(shù)校正后，變成對稱且可用數(shù)學(xué)表達(dá)的線形函數(shù)，這就大大提高了后續(xù)處理能力，包括在單四極桿GC-MS儀器上質(zhì)量數(shù)測定能力。通常來說，利用報(bào)告的質(zhì)量信息，在一定的質(zhì)量偏差內(nèi)，通過搜索全部可能的化學(xué)分子式可以確定元素組成。依賴儀器內(nèi)在的質(zhì)量準(zhǔn)確度，在質(zhì)量偏差范圍內(nèi)得到的分子式均為可能的分子式，如質(zhì)量準(zhǔn)確度達(dá)到1 ppm的儀器，對于500 Da的化合物，限定元素為C、H、N、O、S和Cl時(shí)，待選的化合物有34個(gè)。 眾所周知，每個(gè)分子式具有的同位素分布，理論上來說，這個(gè)同位素分布可作為分子式識別的附加信息。以前，這個(gè)方式用于分子式識別被認(rèn)為是不可行的，因?yàn)楹茈y在給定的儀器上將同位素輪廓圖校正到高于98%的譜圖準(zhǔn)確度[4]，這就限制了使用同位素輪廓圖信息，幫助我們減少通過質(zhì)量測定得到的待選化合物數(shù)量。然而，如果譜圖準(zhǔn)確度能夠提高到99%以上，它就能在質(zhì)量數(shù)得到可能分子式列表中識別出的分子式，或在不經(jīng)常校正的儀器上測定確定的分子式，只要能保證相對較高的質(zhì)量精度。 利用前面描述的儀器校正線形函數(shù)，列表中每個(gè)待選化合物的理論質(zhì)譜圖可以準(zhǔn)確計(jì)算出來，并將其分別與先前校正的測量質(zhì)譜圖比較，高于99%的譜圖準(zhǔn)確度值被計(jì)算出來，用于反映兩者微小且基本不同，然后對給出分子式的可能性進(jìn)行排名，這個(gè)過程叫做校正的線形同位素輪廓搜索(CLIPS)，已經(jīng)證明，CLIPS對于分子式測定優(yōu)于質(zhì)量準(zhǔn)確度。 實(shí)驗(yàn) 全氟三丁胺(PFTBA)校正標(biāo)樣和樣品混合物在Agilent 5973 GC-MS單四極桿系統(tǒng)上測試一周，PFTBA標(biāo)樣通過注射法測試一次，且在一周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)重復(fù)測試一次，混合樣品在兩次PFTBA運(yùn)行中間，以不同濃度分析22次，在這個(gè)分析過程中，利用MassWorks CLIPS (Cerno Bioscience, Danbury, Connecticut)測試盲樣(名義質(zhì)量數(shù)m/z 162)并確定其元素組成。PFTBA和混合樣品在相同MS條件，“raw”模式(非峰檢測，有時(shí)叫做輪廓模式)、質(zhì)量范圍為50-550 m/z且離子閾值為零下采集。 利用次PFTBA運(yùn)行的八個(gè)已知碎片離子，校正全部22次GC-MS運(yùn)行，并計(jì)算盲樣的質(zhì)量數(shù)并確定元素組成，這個(gè)校正也應(yīng)用到第二次PFTBA運(yùn)行，測定同樣八個(gè)碎片離子的質(zhì)量，以測定兩次PFTBA運(yùn)行期間的質(zhì)量漂移。 結(jié)果和討論 圖1顯示了次PFTBA運(yùn)行的總離子流圖，0.8 min的保留時(shí)間窗口用于校正前的譜圖平均。圖2顯示了校正離子C3F5+校正前后的輪廓模式質(zhì)譜圖，表明雖然經(jīng)過很好的調(diào)諧，但質(zhì)譜的輪廓圖沒有已知且可定義的峰形，而校正后的譜圖具有已知且可用數(shù)學(xué)表達(dá)的峰形，校正的質(zhì)譜圖也根據(jù)校正離子的單同位素質(zhì)量平移到正確的質(zhì)量數(shù)位置。由于慣例且不失通用性，本文中得失電子的質(zhì)量差異被忽略，其正確的質(zhì)量與其離子中性形式一致。
圖1. 次PFTBA校正氣運(yùn)行的總離子流圖
圖2. PFTBA校正離子(C3F5+)校正前(黑)后(紅)的質(zhì)譜數(shù)據(jù) 這個(gè)校正被應(yīng)用在一周后的第二次PFTBA運(yùn)行上，表I列出了同樣八個(gè)校正離子的質(zhì)量數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)全部這些離子的系統(tǒng)質(zhì)量漂移約+7 mDa，折合為12- 54 ppm，這個(gè)誤差用于傳統(tǒng)的單一同位素質(zhì)量搜索確定元素組成常常認(rèn)為是太大的。 表I. 后一天校正離子PFTBA數(shù)據(jù)采集處理后得到的質(zhì)量數(shù)
同樣的校正應(yīng)用到一周內(nèi)的22次GC-MS運(yùn)行，圖3畫出了m/z 162離子的質(zhì)量、離子信號強(qiáng)度以及校正后測定出盲樣(煙堿，C10H14N2)的真實(shí)質(zhì)量，該圖在質(zhì)量誤差和信號強(qiáng)度之間展現(xiàn)了很明顯的相關(guān)性，這個(gè)結(jié)果也同文獻(xiàn)[5]預(yù)測和得到的結(jié)果一致。對于強(qiáng)度大于8000 counts，質(zhì)量與真實(shí)質(zhì)量的偏差在幾mDa以內(nèi)，這也同表I估算的整個(gè)質(zhì)量漂移一致，確定兩次PFTBA運(yùn)行所觀察到的整個(gè)質(zhì)量漂移程度相當(dāng)于相同離子強(qiáng)度重復(fù)測試的隨機(jī)波動。換句話說，整個(gè)系統(tǒng)的~7 mDa質(zhì)量漂移誤差，相對質(zhì)量測量本身的隨機(jī)波動是沒有統(tǒng)計(jì)意義的(次PFTBA校正應(yīng)用到全部22次GC-MS運(yùn)行，不會造成重大的系統(tǒng)質(zhì)量測量誤差)。
圖3. 報(bào)告的質(zhì)量準(zhǔn)確度、單同位素峰離子強(qiáng)度和已知m/z 162 Da的真實(shí)質(zhì)量數(shù) 正象文獻(xiàn)[6]報(bào)道，當(dāng)質(zhì)量準(zhǔn)確度作為分子式識別的重要工具時(shí)，通常只識別給定同位素離子的單一同位素峰，由于這個(gè)原因，即使具有1-2 ppm質(zhì)量精度的高分辨質(zhì)譜，在測量的很小質(zhì)量誤差內(nèi)，也有很多待選分子式的單一同位素質(zhì)量落在這個(gè)范圍內(nèi)。譜圖準(zhǔn)確度，一個(gè)獨(dú)立計(jì)量工具，可以計(jì)量測定譜圖與計(jì)算的理論譜圖匹配程度，它包含給定離子更多的同位素分布精細(xì)結(jié)構(gòu)信息，是比質(zhì)量準(zhǔn)確度更重要的信息。另外，由于代表質(zhì)譜儀器線形譜圖的譜圖準(zhǔn)確度不容易受質(zhì)譜波動影響，所以譜圖準(zhǔn)確度相對質(zhì)量準(zhǔn)確度是更可靠的分子識別工具。 162 Da的未知離子，質(zhì)量誤差超過50 ppm(表I和圖3)提供了很好的例子，說明譜圖準(zhǔn)確度相對質(zhì)量準(zhǔn)確度的相對重要性和可靠性。以162 Da離子為未知物，在通常元素C、H、N、O、F和Cl范圍內(nèi)進(jìn)行元素組成搜索，全部22次質(zhì)譜測量利用軟件對這個(gè)離子進(jìn)行處理測定它們的分子式，根據(jù)譜圖準(zhǔn)確度排名，分子式C10H14N2排名位有19次，兩次排在第二位，一次排在第三位(圖4)，這個(gè)分子式后來證明是正確的分子式(煙堿)，排名第二和三的測量均為樣品濃度較低的情況下得到。
圖4. m/z 162(煙堿，分子式C10H14N2，真實(shí)質(zhì)量為162.1157 Da)離子識別 取三次運(yùn)行(24-17-12、26-18-29和31-11-40)作為例子與理論計(jì)算煙堿質(zhì)譜圖進(jìn)行疊加(圖5)，發(fā)現(xiàn)在低濃度運(yùn)行(24-17-12)時(shí)得到好的譜圖匹配，在更高濃度運(yùn)行(26-18-29和31-11-40)得到幾乎的譜圖匹配，這些都反應(yīng)在相應(yīng)的譜圖準(zhǔn)確度這個(gè)度量工具上。圖5說明譜圖準(zhǔn)確度直接同離子信號強(qiáng)度(噪音數(shù)據(jù))相關(guān)，幾乎與時(shí)間或質(zhì)量漂移無關(guān)，表明譜圖準(zhǔn)確度不僅是有價(jià)值的信息，而且是更可靠的分子式識別手段。 圖5描繪了162 Da煙堿離子的質(zhì)譜片斷，161 Da質(zhì)譜峰與煙堿離子具有相同的離子強(qiáng)度，因?yàn)?span lang="EN-US">GC-MS和串聯(lián)MS-MS實(shí)驗(yàn)中，在離子化-碎裂過程中常常有其它離子或碎片引起同位素響應(yīng)疊加，這樣的質(zhì)譜干擾引起162 Da離子系統(tǒng)質(zhì)量測量誤差，圖3的負(fù)質(zhì)量測量偏差就是充分證據(jù)。但這不會影響計(jì)算的譜圖準(zhǔn)確度，因?yàn)?span lang="EN-US">m/z 161 Da
雖然這里使用的單四極桿GC-MS系統(tǒng)，在一周測試期間只有7 mDa或162 Da超過50 ppm的質(zhì)量波動，但對于傳統(tǒng)的質(zhì)量測定元素組成會造成很大偏差，在一周的測試期間，反應(yīng)質(zhì)譜線形譜圖的質(zhì)量準(zhǔn)確度保持不變，不需重新校正就能不斷地進(jìn)行分子式的可靠測定。
結(jié)論
穩(wěn)定性研究表明，這種通過質(zhì)量準(zhǔn)確度和譜圖準(zhǔn)確度的精密校正的分子式識別方式不受時(shí)間波動的影響，另外，分子式測定方式通過分為質(zhì)量準(zhǔn)確度和譜圖準(zhǔn)確度保證其可靠性。在一周測試期間，質(zhì)量準(zhǔn)確度波動約7 mDa，而質(zhì)譜儀器的線形譜圖或譜圖準(zhǔn)確度變化很小，可以不需重新校正實(shí)現(xiàn)分子式的可靠測定，這是通過利用CLIPS內(nèi)置的真實(shí)同位素處理過程實(shí)現(xiàn)的，通過開發(fā)給定離子整個(gè)同位素分布的精細(xì)結(jié)構(gòu)，而不是僅僅依賴單一同位素峰的質(zhì)量數(shù)來實(shí)現(xiàn)的。
圖5. 校正質(zhì)譜圖(紅色)與C10H14N2理論質(zhì)譜圖(青色)的疊加圖(上部為天實(shí)驗(yàn)、中間為兩天后實(shí)驗(yàn)、底部為一周后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)) 參考文獻(xiàn)： (1) J.P. Chen, et al., LC GC, in press. (2) M. Gu, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 764–770 (2006). (3) Y. Wang, Methods for operating mass spectrometry (MS) instrument systems, US Patent 6,983,213, Filed October 20, 2003. (4) T. Kind, BMC Bioinformatics 2006, 7,234 (www.biomedcentral.com/1471-2105/7/234). (5) K.R. Blom, Anal. Chem. 73, 715 (2001). (6) D. Kuehl, Am. Lab Online Edition, January 2008, Page 18, http://americanlaboratory.texterity.com/al-online/200801ol/?pg=18 本文引自 May 2008 Current Trends In Mass Spectrometry 25
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