同位素標(biāo)記化合物的合成和生產(chǎn)中，很難獲得純品，如氘代、14C、¹⁵N等標(biāo)記的化合物通常含有一定量的未標(biāo)記化合物，雖然質(zhì)譜法是檢測(cè)和定量標(biāo)記化合物的最廣泛和最直接的方法，但是標(biāo)記和未標(biāo)記的化合物的各種同位素的A和A+1，…，A+n峰的質(zhì)譜峰信號(hào)重疊相互重疊，使得尤其是存在多個(gè)標(biāo)記位置的環(huán)或存在Cl、Br元素的化合物，他們的質(zhì)譜信號(hào)重疊更為復(fù)雜，即使是使用高分辨率的質(zhì)譜系統(tǒng)（如TOF、Orbitrap）也難以準(zhǔn)確解決定量的問(wèn)題。

盡管一些文獻(xiàn)報(bào)道中提出了各種質(zhì)譜信號(hào)的重疊校正方案，但即使在50%（50﹕50）高濃度的標(biāo)記與未標(biāo)記混合物，其校正誤差也大于±10%，這使得對(duì)5-10%的低濃度的混合物的可靠定量幾乎不可能實(shí)現(xiàn)的。

通過(guò)MassWorks的TrueCal^TM技術(shù)對(duì)測(cè)量的質(zhì)譜信號(hào)峰進(jìn)行峰形校正，來(lái)提高質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)同位素峰型的譜圖準(zhǔn)確度（Spectral Accuracy），以確保使用多元最小二乘法擬合能從校準(zhǔn)的質(zhì)譜圖中計(jì)算出每個(gè)同位素峰的“真實(shí)”貢獻(xiàn)。

考察兩種同位素峰分布復(fù)雜度不同的化合物：第一種是含有一個(gè)Cl原子的D2標(biāo)記化合物——Hydrochlorothiazide-3,3-d2 (HCT-d2)，第二種是含有兩個(gè)Cl原子且¹⁴C 標(biāo)記在苯環(huán)上的化合物——雙氯酚酸鈉。選擇了三種質(zhì)譜系統(tǒng)來(lái)評(píng)儀器定量分析同位素標(biāo)記物的的適用性：ThermoFisher LTQ/Orbitrap、Agilent LC/MSD和WatersXevo TQ LC/MSMS。 在每個(gè)MS系統(tǒng)上，首先在Profile模式下測(cè)量純的未標(biāo)記化合物，然后將其進(jìn)行峰形校正，以評(píng)估可實(shí)現(xiàn)的譜圖準(zhǔn)確度。 再利用譜圖準(zhǔn)確度，對(duì)同位素標(biāo)記的兩種化合物進(jìn)行計(jì)算來(lái)獲得它們中含有的各種標(biāo)記和未標(biāo)記離子的相對(duì)濃度。

D2標(biāo)記含Cl化合物——HCT-d2

未標(biāo)記的HCT（C7H6N3O4S2Cl）在LTQ/Orbitrap下采集的Profile模式數(shù)據(jù)，使用MassWorks處理，獲得的譜圖準(zhǔn)確度約為97.3%（見(jiàn)圖1），標(biāo)記后的HCT-d2的譜圖準(zhǔn)確度又有明顯下降，僅為96.2%，將D2標(biāo)記和未標(biāo)記的HCT按50%：50%混合后的譜圖準(zhǔn)確度下降更為嚴(yán)重，只能達(dá)到92.5%（見(jiàn)圖2），導(dǎo)致的結(jié)果就是MassWorks給出的兩者的相對(duì)濃度出現(xiàn)了±10%的誤差，這種誤差下要準(zhǔn)確計(jì)算標(biāo)記和未標(biāo)記的含量顯然是不可能的。

圖1 MassWorks軟件在LTQ/Orbitrap下測(cè)定的HCT（C7H6N3O4S2Cl）的同位素譜圖準(zhǔn)確度

圖2 MassWorks軟件在LTQ/Orbitrap下測(cè)定的HCT-d2（C7H4N3O4S2ClD2）的同位素譜圖準(zhǔn)確度

將測(cè)試轉(zhuǎn)移到單四極桿的Agilent LC/MSD系統(tǒng)上，測(cè)得的未標(biāo)記的HCT的譜圖準(zhǔn)確度高達(dá)99.0%，標(biāo)記的HCT-d2的譜圖準(zhǔn)確度為98.9%，50%：50%混合物的譜圖準(zhǔn)確度為98.7%（見(jiàn)圖3），結(jié)果表明，單四極桿的LC/MSD的同位素譜圖準(zhǔn)確度測(cè)定準(zhǔn)確。然后進(jìn)一步考察HCT和HCT-d2按不同比例混合的MassWokrs定量測(cè)試效果，每一個(gè)濃度測(cè)定3次，然后數(shù)據(jù)對(duì)比實(shí)際的混合濃度和MassWorks軟件計(jì)算出來(lái)濃度值，結(jié)果見(jiàn)圖4，結(jié)果表明，平均濃度誤差反映了測(cè)量偏差或系統(tǒng)偏差均小于0.6%，且要小于標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD＜1%）。HCT-d2的實(shí)際混合濃度值與軟件計(jì)算值的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R²=0.9996，預(yù)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)誤差SEP=0.53%。

圖3 未標(biāo)記的HCT（上）、標(biāo)記的HCT-d2（中）、HCT/HCT-d2= 50:50的混合物（下），紅色曲線(xiàn)為校正的同位素譜圖，黑色為理論的同位素譜圖

圖4 使用MassWorks的分析得到的不同濃度HCT的定量分析結(jié)果

圖5 HCT-d2的計(jì)算濃度與實(shí)際濃度的線(xiàn)性關(guān)系

¹⁴C標(biāo)記含Cl化合物——HCT-d2

雙氯芬酸鈉(C14H10NO2Cl2Na)，含有2個(gè)Cl原子，苯環(huán)上可被標(biāo)記的¹⁴C的數(shù)量為0~6個(gè)，¹⁴C標(biāo)記后的化合物的同位素峰分布比HCT-d2更為復(fù)雜，使用LTQ/Orbitrap應(yīng)對(duì)7種潛在共存混合物的準(zhǔn)確定量任務(wù)來(lái)說(shuō)是一個(gè)挑戰(zhàn)。然而，當(dāng)用Waters Xevo TQ LC/MSMS測(cè)量時(shí)，從供應(yīng)商購(gòu)買(mǎi)的放射性的¹⁴C標(biāo)記化合物的譜圖準(zhǔn)確度達(dá)到了98.9%（見(jiàn)圖6），MassWorks軟件計(jì)算出來(lái)的0~6個(gè)¹⁴C標(biāo)記化合物的各自的濃度比（圖7），計(jì)算出來(lái)的總的放射性比活性為62.6%，這與供應(yīng)商提供的62.7 mCi/mmol值非常一致。圖8為按不同比例混合的標(biāo)記和未標(biāo)記化合物的定量分析結(jié)果，標(biāo)記物的混合濃度值與軟件計(jì)算濃度值的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2=0.9989，預(yù)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)誤差SEP=1.98%。

圖6 未標(biāo)記雙氯酚酸鈉（上）和標(biāo)記的雙氯酚酸鈉（下）的譜圖準(zhǔn)確度結(jié)果

圖7 MassWorks給出的標(biāo)記的雙氯酚酸鈉的校正質(zhì)譜圖及其中所有化合物的相對(duì)含量

圖8 使用MassWorks的多元線(xiàn)性分析得到的不同濃度雙氯芬酸鈉的定量分析結(jié)果

圖9 雙氯芬酸鈉14C標(biāo)記物的計(jì)算濃度與實(shí)際濃度的線(xiàn)性關(guān)系

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MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開(kāi)發(fā)的一款革命性的MS數(shù)據(jù)定性分析軟件，能幫助我們?cè)诘头直媛实乃臉O桿GC/MS、LC/MS直接測(cè)定化合物的精確質(zhì)量，并通過(guò)獨(dú)有的譜圖準(zhǔn)確度概念確定出準(zhǔn)確的分子式。MassWorks軟件同樣適用于高分率質(zhì)譜（TOF、Orbitrap）的定性分析。

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