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繼甘肅省出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心周圍主任等，利用MassWorks質(zhì)譜校正技術(shù)在Rapid Commun. Mass Spectrom（2011, 25, 3097–3102）發(fā)表高水平外文文章后，浙江大學用戶在Industrial & Engineering Chemistry Research（美國）上發(fā)表英文文章《Application of Multivariate Curve Resolution Method in the Quantitative Monitoring Transformation of Salvianolic Acid A Using Online UV Spectroscopy and Mass Spectroscopy》，采用MassWorks在單四極桿質(zhì)譜上測定了丹酚酸A兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù)，并利用譜圖準確度實現(xiàn)了對這兩種產(chǎn)物分子式的準確識別。

多元曲線分辨法在在線紫外光譜和質(zhì)譜定量檢測丹酚酸A轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

Xintian Zheng，Xingchu Gong，Qin Li，Haibin Qu

（浙江大學藥物信息研究所）

摘要：本文應(yīng)用在線紫外光譜檢測分析系統(tǒng)對丹酚酸A（SAA）的轉(zhuǎn)化過程進行了探索性研究。一種基于多元曲線分辨的化學計量學方法應(yīng)用于解決反應(yīng)物濃度和譜圖分布問題從而評價動力學分布。為研究溫度和pH兩個因素對SAA轉(zhuǎn)化過程的影響，動力學測試將溫度設(shè)定在25-90℃，pH值設(shè)定在2.5-10范圍內(nèi)。SAA轉(zhuǎn)化過程中首先發(fā)生降解反應(yīng)，當溫度升高時，SAA的降解速度加快。當pH值高于7時，SAA轉(zhuǎn)化速度加快，當pH值小于6.5時則可保持穩(wěn)定。用MassWorks軟件結(jié)合單四極質(zhì)譜測定了SAA的兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù)，并借助譜圖準確度實現(xiàn)了對這兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的確證。結(jié)果表明，在中藥制劑生產(chǎn)過程中，作為主要生物活性物質(zhì)的SAA不應(yīng)在高溫和高pH值條件下生產(chǎn)。

1 前言

丹酚酸A（SAA）是丹參的主要有效成分，具有多種藥理活性，包括抗血小板、抗肝纖維素化、消炎、抗癌等特性¹。SAA的這些功能據(jù)推測源于其強大的抗氧化性^2-7。因此，SAA作為一種新的待開發(fā)藥物在制藥領(lǐng)域受到廣泛的青睞。作為咖啡酸和丹參素的三聚體，SAA在水溶液中和丹參的某些制備過程中是不穩(wěn)定的⁸。在整個加工過程中加熱或強酸強堿都可能導(dǎo)致SAA的轉(zhuǎn)化。無疑，SAA的穩(wěn)定性將會影響SAA制備藥物的功效和安全性。

至今，對中藥材不穩(wěn)定生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化或降解的研究較少^9-11。而且這些研究都是應(yīng)用離線檢測方法。這些離線檢測方法通常費時費力，當轉(zhuǎn)化很慢時可適用。然而，當轉(zhuǎn)化速度較快時，水解、氧化和沉淀等副反應(yīng)在離線樣品測定過程中可能同時發(fā)生。因此，需要一種實用、快速且無損的在線監(jiān)測方法，如連續(xù)流動系統(tǒng)。這種在線監(jiān)測具有重現(xiàn)性好、過程自動化、樣品和試劑消耗低等優(yōu)點。同時還可對降解過程進行動力學研究¹²。

本文采用在線紫外光譜檢測方法監(jiān)測了SAA的轉(zhuǎn)化過程。多元曲線分辨法可用于解決吸收分布、反應(yīng)物光譜提取和輔助定量等問題。結(jié)果用于動力學模型而得到速率常數(shù)。MassWorks軟件結(jié)合單四極質(zhì)譜分析提供了有關(guān)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可能標示的確證信息。

2 材料和方法

2.1 試劑和藥品：純度大于95%的SAA及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過HPLC分析，在本實驗室得到分離純化。色譜級乙腈和甲酸分別購自Merck（Darmstadt，德國）和Tedia（Fairfield，OH，USA）。高純水通過Millipore Milli-Q系統(tǒng)（Milford，MA,USA）制備。其他化學物質(zhì)均為分析純。

2.2 儀器條件：T6紫外分光光度計（Pukinje,Beijing,China）帶win5軟件（Pukinje,Beijing,China），用于光譜采集，設(shè)置如下：掃描范圍220-400nm，數(shù)據(jù)間隔1nm，中等掃描速度，5mm石英流通池通路。

    連續(xù)流路由K501泵（Lumtech Analytical，Germany）、一個水浴反應(yīng)器，一個流通池和一個蠕動泵管（200cm*2mm ID）組成。過程中，泵以20ml/min的流速連續(xù)提供樣品，樣品溶液在9s內(nèi)到達檢測器流通池。在線紫外分光光度分析系統(tǒng)示意圖如圖1所示。

圖1 在線紫外分光光度法分析系統(tǒng)示意圖，P為二元泵，流速20ml/min.T為溫度控制系統(tǒng).PC為光譜采集的工作站.水浴設(shè)置不同的溫度如表1所示。

   安捷倫單四極桿質(zhì)譜（Agilent, IL,USA）帶ESI接口用于質(zhì)譜檢測分析。所有樣品通過過濾器直接注入質(zhì)譜分析而不過柱子分離。流動相為0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B）。流速為0.5ml/min。高純氮用作干燥氣。電噴霧負離子模式監(jiān)測參數(shù)設(shè)置如下：毛細管溫度350℃，毛細管電壓3500V，干燥氣流速10ml/min，霧化氣電壓40psi。全掃質(zhì)譜分析，譜圖掃描在100-800m/z范圍內(nèi)。掃描數(shù)據(jù)以完整模式存儲用于MassWorks（Cerno Bioscience）分析。同時，離子閾值設(shè)為0，采集速率為0.05。

2.3 步驟：略。

2.4 多元曲線分辨法：略。

2.5 反應(yīng)產(chǎn)物的確證：不同的時間間隔，應(yīng)用質(zhì)譜法采集和分析每份20ul的樣品，來確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。為得到穩(wěn)定的信號，每個樣品掃描2min。得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MassWorks軟件分析。SAA作為純標準用于內(nèi)標校正。MassWorks軟件提供了轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的計算的質(zhì)量數(shù)和可能的分子式。

3. 結(jié)果和討論

3.1 SAA轉(zhuǎn)化中溫度和pH的影響：略。

3.2 MCR-ALS分析轉(zhuǎn)化實驗：略。

3.3 動力學計算：略。

3.4  SAA轉(zhuǎn)化過程的質(zhì)譜分析：本實驗的MCR結(jié)合UV分析方法沒有排除反應(yīng)終產(chǎn)物為單組分的多種物質(zhì)共存的情況。本實驗提到的反應(yīng)中，同樣動力學分布得到的許多物質(zhì)的分子式（例如，兩種物質(zhì)具有相同的濃度分布和譜圖分布）能夠產(chǎn)生所謂的譜圖矩陣秩脫。所以，許多物質(zhì)被認為是許多不同分子結(jié)構(gòu)的混合物，而不是單一分子結(jié)構(gòu)的純凈物。

反應(yīng)系統(tǒng)中化學物通過質(zhì)譜檢測和MassWorks軟件的進一步證實進行確證。MassWorks軟件能夠提供這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù)。采用包括質(zhì)荷比和峰形的全面校正得到較高的譜圖準確度，達到更準確的組分檢測³⁴。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的準分子離子峰為509和491。結(jié)果列于表2和表3，說明在反應(yīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物C₂₆H₂₁O₁₁和C₂₆H₁₉O₁₀。結(jié)果與我們之前研究的SAA（C₂₆H₂₂O₁₀,[M-H]- M/Z=493）90℃下在水溶液中被氧化，反應(yīng)產(chǎn)物包括丹酚酸C（C₂₆H₂₀O₁₀，[M-H]- M/Z=491）異丹酚酸C（C₂₆H₂₀O_10, [M-H]- m/z=491）和兩種新的多酚酸（C₂₆H₂₂O₁₁，[M-H]- M/Z=509）³⁵的結(jié)果相同。這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的標準質(zhì)譜圖如圖7所示，基于MCR得到這些產(chǎn)物的質(zhì)譜。4種氧化產(chǎn)物相似的紫外光譜圖如圖8。MCR-ALS軟模式分離和鑒定的的每個物質(zhì)的光譜圖說明其有著本質(zhì)的區(qū)別。相反，MCR結(jié)合紫外光譜方法是一種有效的方法，不需要分離，因此，其在在線化學過程監(jiān)測中是一種很有用的方法。

表2  MassWorks軟件分析的SAA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分子離子[M-H]^-m/z=491^a的結(jié)果

^a表示主要基于譜圖準確度得到的前十個可能結(jié)果的排序，^bRMSE為根均方誤差，^cDBE為雙鍵當量

表3  MassWorks軟件分析的SAA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分子離子[M-H]^-m/z=509^a的結(jié)果

^a表示主要基于譜圖準確度得到的前十個可能結(jié)果的排序，^bRMSE為根均方誤差，^cDBE為雙鍵當量

4. 結(jié)論

略。

文獻

   略

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