H.E.L 生物合成研究：細(xì)菌的氣體培養(yǎng)--BioXplorer 生物反應(yīng)器應(yīng)用案例

前言

合成生物學(xué)（Synthetic Biology）是一門新興的跨學(xué)科領(lǐng)域，它結(jié)合了生物學(xué)、工程學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)以及遺傳學(xué)等多個學(xué)科的知識和技術(shù)。合成生物學(xué)在生物制造領(lǐng)域的應(yīng)用是其最引人注目的方面之一。生物制造，也稱為生物加工或生物生產(chǎn)，是指利用生物體（如細(xì)菌、酵母、真菌、植物或動物細(xì)胞）來生產(chǎn)化學(xué)品、燃料、材料和藥物的過程。

合成生物學(xué)在生物制造領(lǐng)域的優(yōu)勢包括：

可持續(xù)性：生物制造過程通常使用可再生資源，如糖、淀粉或纖維素，而不是依賴于有限的化石燃料。

環(huán)境友好：生物過程往往產(chǎn)生較少的有害廢物和副產(chǎn)品，有助于減少環(huán)境污染。

成本效益：隨著技術(shù)的進(jìn)步，生物制造過程可能會變得更加經(jīng)濟(jì)高效，因?yàn)樗鼈兛梢詼p少能源消耗和原材料成本。

正是由于生物合成有諸多的優(yōu)勢，現(xiàn)在引起了人們的極大興趣。

案例：通過CO2、H2和O2高密度培養(yǎng)真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌生產(chǎn)聚（D-3-羥基丁酸鹽）的研究

背景：微生物聚酯由于其在工業(yè)生產(chǎn)生物可降解塑料中的潛在應(yīng)用，最近引起了相當(dāng)大的關(guān)注和興趣。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌菌株具有在細(xì)胞內(nèi)積累聚羥基烷酸（PHAs）的能力。在PHA產(chǎn)生細(xì)菌中，真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes eutrophus是研究得最透徹且在PHAs研究中最廣泛使用的菌株。這種微生物最初被分離為一種氫氧化細(xì)菌，能夠利用二氧化碳、氧氣和氫氣作為底物自養(yǎng)生長，并在氧氣和或營養(yǎng)限制的培養(yǎng)條件下在細(xì)胞內(nèi)積累聚-D-3-羥基丁酸（P(3HB)）。因此，利用能夠同化二氧化碳的Alcaligenes eutrophus生產(chǎn)可生物降解塑料，在很大程度上有助于解決兩個環(huán)境污染問題：（i）大氣中二氧化碳水平的增加，以及（ii）不可生物降解塑料廢物的處理。然而，在大規(guī)模和經(jīng)濟(jì)地應(yīng)用Alcaligenes eutrophus的自養(yǎng)培養(yǎng)之前，需要克服相當(dāng)大的技術(shù)挑戰(zhàn)。其中，特別是隨著培養(yǎng)容器中底物氣體的耗盡，利用效率的損失問題，以及可能發(fā)生的嚴(yán)重氣體爆炸的潛在風(fēng)險(xiǎn)，需要特別處理。

研究方法：在自養(yǎng)培養(yǎng)過程中，需要消除氣體爆炸的可能性。研究者開發(fā)了一個帶有安全特性的閉路循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)，通過維持底物氣體相中的氧氣濃度低于氣體爆炸下限（6.9%）來實(shí)現(xiàn)安全培養(yǎng)。使用了一個帶有籃子式攪拌器的培養(yǎng)容器，這種攪拌器的設(shè)計(jì)使得KLa（氧傳遞系數(shù)）達(dá)到了2970h-1。此外，氧氣氣體也直接從其他氣體中分離出來，單獨(dú)供給發(fā)酵器。

結(jié)論：在氧氣限制條件下，經(jīng)過40小時(shí)的培養(yǎng)，獲得了91.3 g.dm-3的細(xì)胞和61.9 g.dm-3的P(3HB)。這些結(jié)果與通過異養(yǎng)發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)P(3HB)的報(bào)道結(jié)果相比具有優(yōu)勢。特別設(shè)計(jì)的籃子式攪拌器在提高KLa值方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，這對于在低氧濃度下維持高細(xì)胞密度和P(3HB)生產(chǎn)至關(guān)重要。

產(chǎn)品應(yīng)用

生物合成：Alcaligenes eutrophus細(xì)菌培養(yǎng)以生產(chǎn)聚(D-3-羥基丁酸)（P(3HB)）的詳細(xì)步驟：

? 培養(yǎng)準(zhǔn)備：

使用Alcaligenes eutrophus ATCC 17697菌株。準(zhǔn)備礦物質(zhì)培養(yǎng)基用于預(yù)培養(yǎng)和主培養(yǎng)。

? 種子培養(yǎng)：

在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的循環(huán)氣體封閉回路培養(yǎng)系統(tǒng)中，使用200 cm3規(guī)模的罐式發(fā)酵器進(jìn)行種子培養(yǎng)。

? 主培養(yǎng)：

將100ml種子培養(yǎng)液用于在實(shí)驗(yàn)工廠規(guī)模的培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行主培養(yǎng)。

? 培養(yǎng)條件：

工作體積設(shè)為1 dm3。使用pH控制器自動添加12%氨水，維持pH值在7.0。溫度維持在30℃。攪拌速度設(shè)為700 rpm。底物氣體混合物的供給速率為2 dm3/min（相當(dāng)于2vvm，即每分鐘體積通風(fēng)率）。

? 氣體循環(huán)系統(tǒng)：

使用玻璃罐式發(fā)酵器（總體積2 dm3）作為反應(yīng)器。氣體室（總體積2 m3）充滿氫氣、氧氣和二氧化碳。氣體通過泵混合，然后通過無菌過濾器和循環(huán)泵送入發(fā)酵器。發(fā)酵器中未消耗的氣體返回氣體室，并通過氣體回流線再次供應(yīng)給發(fā)酵器。

? 安全措施：

安裝壓力傳感器，當(dāng)內(nèi)部壓力超過0.5 kg/cm2時(shí)，將氣體排放到室外。所有電氣設(shè)備均為防爆型。氣體室和所有相關(guān)設(shè)備安裝在室外，氣體回收線用油絕緣處理。使用可燃?xì)怏w探測器與氣體供給線的關(guān)閉裝置相連，以便在檢測到系統(tǒng)泄漏時(shí)中斷氣體供應(yīng)。

? 氧氣供應(yīng)：

通過防爆電磁閥和溶解氧（DO）控制器，間歇性地將純氧直接供應(yīng)到培養(yǎng)液中。DO控制器的初始設(shè)定值為1.8 ppm，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，手動降低設(shè)定值，以確保返回線中的氧氣濃度不超過爆炸下限。

? 監(jiān)測與分析：

使用氣相色譜法測定氣體相的組成。使用膜型DO電極監(jiān)測培養(yǎng)液中的溶解氧濃度。通過光譜光度計(jì)測定細(xì)胞濃度，并將其轉(zhuǎn)換為干細(xì)胞重量。通過氣相色譜法測定P(3HB)的濃度。

? KLa值測定：

使用亞硫酸鹽氧化法在以下條件下測定KLa值：工作體積1 dm3，通氣率2 vvm，攪拌速度700 rpm，溫度30℃。

? 發(fā)酵結(jié)果：

初始?xì)怏w混合物組成為H?:O?:CO? = 85.2:6.3:8.3。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，微生物指數(shù)增長，特定生長率約為0.25 h?1。當(dāng)細(xì)胞濃度增加到約10.1 g.dm?3后，溶解氧濃度降至約0 ppm，此時(shí)開始積累P(3HB)。在氧氣限制條件下，經(jīng)過40小時(shí)培養(yǎng)，細(xì)胞濃度增加到約91.3 g.dm?3，P(3HB)濃度為61.9 g.dm?3。

H.E.L的BioXplorer 生物反應(yīng)器專為生物培養(yǎng)、生物合成設(shè)計(jì)：從培養(yǎng)條件控制（溫度、攪拌、pH）、自動液體氣體進(jìn)料、代謝狀態(tài)監(jiān)測（細(xì)菌濃度、尾氣分析）、實(shí)時(shí)在線數(shù)據(jù)記錄分析等方面為客戶提供完全的解決方案。

來源：Tanaka, K., Ishizaki,A., Kanamaru, T., & Kawano, T. (1995). Production of poly(D-3-hydroxybutyrate) from CO2, H2, and O2 by high cell density autotrophic cultivation of Alcaligenes eutrophus. Biotechnology and Bioengineering, 45(3),268-275. 

關(guān)于HEL：

H.E.L——Hazard Evaluation Laboratories 成立于1987年，總部設(shè)在倫敦，在中國、美國、德國、意大利、印度擁有分公司。全資的赫伊爾商貿(mào)（北京）有限公司于 2020年在北京設(shè)立。

H.E.L最初是一家過程工藝優(yōu)化及反應(yīng)危害評估的專業(yè)咨詢機(jī)構(gòu)，對研究機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)承接工藝過程研發(fā)項(xiàng)目；同時(shí)提供安全咨詢，包括事故調(diào)查、HAZOP研究、安全設(shè)施的設(shè)計(jì)及制度管理等。目前，H.E.L是全球首屈一指的過程工藝及安全專業(yè)咨詢機(jī)構(gòu)，同時(shí)已經(jīng)發(fā)展成為一家致力于為客戶提供專業(yè)的過程工藝優(yōu)化及反應(yīng)危害評估設(shè)備的國際集團(tuán)企業(yè)。

關(guān)于綠綿科技

　　2001年成立的北京綠綿科技有限公司(簡稱：綠綿科技)以體現(xiàn)客戶服務(wù)價(jià)值為宗旨，以專業(yè)精神和技能為廣大實(shí)驗(yàn)室分析工作者提供樣品前處理、樣品制備及分析、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精確分析和管理的全面解決方案，致力于協(xié)助客戶提高分析檢測的效率和水平。

　　主要代理產(chǎn)品：GC/MS/MS,LC/MS/MS新機(jī)租賃業(yè)務(wù)/LUMTECH循環(huán)制備液相/靜音型雙頻超聲清洗/Knauer研發(fā)，中試和生產(chǎn)脂質(zhì)納米顆粒（LNP)碰撞噴射混合器系統(tǒng)/冰點(diǎn)滲透壓儀、液相/超高壓液相色譜儀、在線SPE液相色譜儀/法國F-DGSi氮?dú)猓呒儦錃鈿怏w發(fā)生器，液氮發(fā)生器/Cytiva生命科學(xué)設(shè)備/LabOS實(shí)驗(yàn)室運(yùn)營系統(tǒng)/MassWorks準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測定及分子式識別系統(tǒng)/MsMetrix氣質(zhì)香精香料分析軟件/Sin-QuEChERS農(nóng)殘凈化柱/制藥企業(yè)質(zhì)量回顧性報(bào)告系統(tǒng)（QRS)/英國赫伊爾生物反應(yīng)器，電池絕熱量熱、催化劑合成。

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